犬细小病毒单克隆抗体在治疗犬细小病毒病 上的应用研究

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本试验采用犬细小病毒单克隆抗体(CPV McAb)配合静脉注射用犬免疫球蛋白及静

* n% l, l9 _. ?脉注射用犬血白蛋白对343例患细小病毒病的犬，经股内侧肌肉注射进行治疗，取得令

' A9 I3 U7 m$ @  j0 I人满意的结果。1．在收治的343例病犬中，治愈279例，治愈率高达81．34％，显著高于
7 H3 z' v) N# c% y1 C& P0 G# {
其他治疗方法的治疗效果。2．在收治的343例病犬中，6月龄以下幼犬占90．67％，说明

, ~& J3 L/ l9 O7 J) p# I6 d8 k0 x本病主要发生于6月龄以下。冬季发病较多，其次为深秋或初春，夏季发病较少。3．在
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临床治疗中发现，发病一天的病犬注射CPVMcAb、静脉注射用犬免疫球蛋白和静脉注射
0 z8 S$ d! z$ @$ o6 j- |
用犬血白蛋白，而不采取其他措施，89．47％病犬即可二天内完全康复，发病2天的病犬

116只，结合对症疗法用这些药物治疗时，治愈90只，死亡44只，治愈率为77．59％。
  x0 _; b2 S) a9 R. ]8 i8 y! F
发病3天的病犬，治愈率仅为54．84％，而发病4～5天的病犬，治愈率又升高为76％。另

4 U9 i# h" o* k& ]4 I5 z, h1 d外，94．62％的治愈犬用药后4天内完全康复，说明采用该治疗方法治疗还可缩短病程。

) Y  S2 Z- R+ r( {$ @: k9 v  S4．用该药物治疗后当天死亡的病犬，主要是由于发病后期，全身性衰竭、肠道广泛性出
9 I4 J* S# f9 v2 k" t
4 i( ~- j3 d: [' \3 V* t血、坏死和严重脱水，注射的CPV McAb未能起作用。3天后死亡的病犬，可能是由于

( F/ ^" @& I* \" S% RCPV McAb虽然中和了体内病毒，但实质脏器的病变未能修复所致。5．通过与以前以抗病

毒药(利巴韦林)为主要药物、以抗犬细小病毒血清为主要药物以及单纯使用单克隆抗

体为主的治疗方法的比较发现，用犬细小病毒病单克隆抗体，配合使用静脉注射用犬免

3 B- O+ `' R* ~+ |  _' ]疫球蛋白及静脉注射用犬血白蛋白的综合性治疗明显地提高了治愈率。6．经邻近腹股沟
2 W8 \/ S, {- q& F' i
淋巴结的股内侧肌肉注射，进入体内的McAb能迅速到达淋巴组织，中和淋巴组织及血

0 m$ f8 e8 r& |9 e4 x循环中的病毒，阻止其进一步复制和扩散：同时，被中和的CPV和McAb形成抗原抗体

复合物，可促进机体的主动免疫反应，从而达到治愈病犬的目的。7．虽然McAb已开始

用于对某些肿瘤、自身免疫性疾病及移植排斥反应的治疗，但抗病毒McAb治疗中的

0 H8 }4 R0 l. U应用仍停留在实验研究阶段。

关键词：犬细小病毒单克隆抗体犬免疫球蛋白 犬血白蛋白
. C- d1 M, q4 [- ?* ~) t9 R5 g) |
7 X) q) S9 C! l
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. m/ s7 @$ r' o) c前言

7 K# m- M8 t# T犬细小病毒病是由犬细小病毒(CpV)引起的一种急性传染病，临床上多以出血性
5 ^; Z* }! l( K0 o( [# f: U6 Q
肠炎或非化脓性心肌炎为主要特征。有时其感染率可达100％，致死率可达10％～50％，

- E8 p1 R, {8 Y! D+ M解放军军需大学于1982年在长春地区首次分离出该病原——犬细小病毒，证实了我国

6 ]  d# f7 g( D/ i有本病的存在。病犬是本病的传染源，病犬的粪、尿、呕吐物和唾液中含病毒量最高。

本病主要通过直接或间接接触传染。虽然犬细小病毒的发现时间不长，但由于该病的危

8 R5 g) G. {3 S害性极大，各国的动物医学家对该病的病原、流行病学、症状、病理变化、免疫、诊断、

, E( `: R% G/ C* a治疗等方面都进行了深入的研究，特别是在快速诊断和治疗上有了较为明显的共识，即

/ w" |% a2 p2 B0 A. l以特异性治疗为主的综合治疗。随着宠物业的发展和科技的不断进步，对该病的诊断方
! ^9 `3 W% A- o8 Y; [' O
! u) ^) }! m/ V) J6 @' O' m$ y8 ]1 Z法和治疗手段都有了长足的进步，治疗效果也越来越好。早期治疗犬细小毒病的方法主

要是以抗病毒药为主的综合治疗，随后又经历了以抗病毒血清为主要药物的治疗阶段和
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现在以犬细小病毒单克隆抗体(McAb)为主要药物的治疗阶段，疗效逐步提高。一段时
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间以来，上海农林职业技术学院附属动物医院在临床上用犬细小病毒单克隆抗体配合以
0 c. D3 {- }" @  C
  ^* j$ B, f1 @, K静脉注射用犬免疫球蛋白和静脉注射用犬血白蛋白，同时视病犬情况配合其他疗法，同

0 q6 \1 I2 j; t- O1 }! E- S: D/ W* U% _以前治疗方法相比，明显提高了治愈率，使我院附属动物医院在该病的治疗上进入了一

% a2 y+ f( D3 c! m7 k个新的阶段。本研究将单克隆抗体配合犬免疫球蛋白及犬血白蛋白应用于犬细小病毒病
0 C  r/ F3 v# ]) [* k) t
8 e$ B+ M. [5 ?/ ]% @. K& W: b: P1 D8 j这一急性烈性传染病的临床治疗，收治病例全部为自然发病犬，治愈率高达81.34％，对

# B; g% B1 H" y& y应用犬细小病毒单克隆抗体配合犬免疫球蛋白及犬血白蛋白这一治疗方法作了进一步

8 Y5 F2 Q/ }$ Z9 S' C8 }4 Z2 Y的验证，表明该方法疗效确实，同时对其他动物病毒性疾病的l临床治疗也具有一定的参

( b4 z# z8 T7 ?: E考价值。


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第一章犬细小病毒与犬细小病毒病

§1．犬细小病毒

# N$ Q& f. c+ C- t" w: d$ S§1．1犬细小病毒的起源

犬细小病毒(Canine parvovirus，CPV)属于细小病毒科细小病毒属猫细小病毒亚
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5 Z+ v; c4 z- @# S6 W群[16]，本亚群中与CPV密切相关的成员还有猫泛白细胞减少症病毒(Feline

panleukopenia virus，FPV)、貂肠炎病毒(Mink enteriti s virus，MEV)和浣熊细小
* I* X. M+ A1 i
) r, {' B3 f, |! K1 @& y5 n) X病毒(Raccoon parvovlirus，RPV)等。CPV是1977年由美国学者Eugster和Nairn E271从

患出血性肠炎的病犬粪便中首先观察到，1978年由澳大利亚的Kelly[38]和加拿大的
+ y. P4 s) r. u
Thomson等首次从患肠炎的病犬中分离到，随后在法国、日本、南非和意大利相继报道
2 S7 I* Y+ Q7 l
) c, E2 B6 x* a; R5 q- S  u本病。早在1967年，Binn等。[21]从犬分离到第一种犬细小病毒～犬微病毒(minute virus
" i* b! o6 h. y1 b3 i& z, [
of canine，MVC)，又名CPV—l。因此，这次分离到的CPV被命名CPV-2，CPV一2在致病
: N" k( z, S9 U. G4 [" v
" s: }0 P2 Y0 j. i# @# p8 \+ O9 O6 z' f性和抗原性上与CPV-1显著不同。CPV一2主要引起犬的出血性肠炎和幼犬的心肌炎，具
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9 X; O% f/ k' P+ ^; r( u有很高的发病率和死亡率，症状与FPV相似。而CPV一1起初认为是非致病性的，但最近
4 x& X& v: T8 o. z4 k
% E3 x  ]4 r, |0 e0 l, ^7 Q5 @的研究表明CPV一1可能引起怀孕母犬的胎儿吸收和流产。
$ {( Y5 m1 I  t3 X
1 G; N1 F5 C, T4 ]从1980年起在我国的军犬、警犬、观赏犬和肉用犬等陆续出现该病的疑似病例，
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感染的多半是离乳前后的幼犬，临床表现为剧烈的呕吐、腹泻、排出恶臭的粪便，故又
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称出血性肠炎，病死率高达50％～80％。我国梁士哲(1982)““等最早报道了类似CPV-2
, U! C8 A" U) i" \
所致的犬出血性肠炎，次年徐汉坤[15]等正式报道了本病的流行。

8 P4 L, G8 f$ o3 ?. Z  I( b在70年代后期，犬还没有进行过CPV一2的免疫，根据血清学追溯性调查，在1974
& S/ C' t# [% I7 \1 t
% v) ?  l- K2 ~  ]: x6 U  I" V5 J9 b年之前(希腊最早于1974年发现CPV-2阳性血清)没有证据显示有类似于CPV-2的病
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原存在的报告。在1976年，欧洲犬的血清中有抗体。在世界上许多其他的地区直到1978
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年才发现CPV一2的阳性血清。在1978年CPV一2引发的疾病逐渐增多，病原是最初的CPV一2

$ u4 _9 ]9 j: @, L0 M型。随后即发生了抗原漂移，Parrish等[43]指出大约在1979～1981年之间，CPV一2在抗
0 ^$ e8 g/ }7 v/ N" P4 ~
原性上和基因型上被变异株CPV-2a自然取代了。在1979年，变异株CPV-2a引发的疾
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病增多了。到1981年，CPV一2a型是美国临床病犬中最常分离到的病原，同样在日本、
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澳大利亚、丹麦也一样，从1981年以后，CPV一2很少被分离到。大约在1984年，新的
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5 C$ n7 \) a5 @' j* \% N& h变异株CPV一2b在美国被通过单克隆抗体检测到，并逐步流行开来。目前，CPV一2b出现

的最早记录是日本的1982年CPY—Y株(GenBank：026709)［23］。Parrish［24］等通过对美国
5 T+ d& y( ?: k8 S3 z1 k) p
92株分离物检测，表明从1978～1990年各种抗原型变化随着时间不同而不同。CPV一2到
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9 D3 X/ g4 d& U9 a6 fCPV一2a的变化在1979～1981年。CPV一2b抗原型的变化在1984年才发现。到1988年，
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- A0 D, b2 h# a7 n在美国，CPV一2b是发病犬中最常分离到的抗原型，但是在其他国家，CPV一2a和CPV一2b
2 J/ D' p4 _1 `( T( p

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( v: Q; Q2 T/ z3 K, [' R! N出现的机会是均等的。CPV一2a和CPV-2b还具有了感染猫的功能。我国自1982～1996

年分离到的均为CPV-2a，从1997年开始分离到了CPV一2b，随着时间的推移，分离到
! X( w, o5 S! ]; y7 x7 k/ {
CPV-2b的数量成上升趋势。

1 c6 g! h$ Z( z* f, x9 y5 u§1．2．CPV-2的生物学特征

4 E) J7 `1 v* `+ D§1．2．1 CPV-2形态和理化性质
* H% W; X- w7 [, Q; x/ j& ~
, K' V8 w3 d9 t" E- @7 dCPV-2粒子为等轴对称的二十面体。病毒无囊膜。核酸由单股DNA组成。在电镜下

4 }$ h( a, }+ H0 ^显圆形或六角形。直径约22nm。据对部分病毒的分析。DNA约占整个病毒的粒子重要的
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25～34％。DNA分子量为1．4＊10 6次方～1．7＊10 6次方。在氯化铯观察密度梯度离心沉淀时。大部分
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2 j# T: h+ w" m4 G% k感染性病毒粒子存在于1．38～1．42／cm3。少部分感染性病毒粒子存在于1．45～1．47／cm立方。

5 Z. y1 O% H. v! w5 V3 W* l% e2 d; l9 S多数病毒离心中含有3种多肽、VP1(70～90KD)，VP2(62～76KD)和vP3(39～69KD)。VP2
, N0 P% J: X2 O+ i- ^( a
8 W" ]" [- j$ w' F! ?系构成衣壳蛋白成分，是具有血凝活性的物质。

( d& S: g" ^6 s§1．2．2 CPV-2的血凝特性
) i! T3 g( G7 I/ ]& T
CPV能凝集恒河猴、猪、马、猫和仓鼠的红细胞。Senda等报道应用硼酸缓冲液和
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病毒调节稀释剂(Virus Adjusting Diluent．VAD)能凝集犬和绵羊的红细胞，但不能

0 ?5 \% Y- K- \+ Q+ @( a5 g+ n凝集牛；山羊；兔；豚鼠：大鼠；小鼠；地鼠；鸡；鹅和人的O型红细胞。FPLV和MEV
# P9 ~' i+ T8 m
也能强烈凝集恒河猴；猪的红细胞但不能凝集猫的红细胞三种病毒凝集红细胞最适
1 _9 X4 p3 p( j  p- f8 T. I* R
- b* b4 O0 ^+ T! M& Q- F7 Y; {pH5．8～6．O，但CPV在pH7．2时也能很好凝集红细胞。而FPLV，MEV，当pH>6．4时血凝

  p" V# O6 u1 w活性明显下降，此外，pH<6．5时，猪的红细胞又易发生自；疑。据报道，在同样的条件(红
1 ]" w6 y9 e& ]% Z# V
细胞；温度；pH值)下，CPV的血凝试验(HA)滴度至少比FPLV和MEV高8倍。

: P; a( j$ O9 I8 [" O* u4 qSenda等报道．在日本1980年以前分离的CPV株为温度依赖型，以4摄氏度时凝集效果

) x. |! p: ~3 v8 z! L. u6 Q+ [! j最佳。其抗原性和血凝性与FPLV，MEV基本相似。而1980年后期及1980以后分离到的
( n; o% p% a8 {6 V" l/ k
CPV株逐渐变成温度不依赖型，不论在4摄氏度，还是37摄氏度，血凝滴度基本不变。而温度

依赖型CPV株及FPLV；MEV在37摄氏度的血凝滴度比4。C时至少低16倍，时间过长会从
8 k, W& U) I' [9 w
红细胞上解脱下来，可用此法提取和浓缩CPV，温度不依赖型侏抗原性与FPLV；MEV有
  H4 E( ]) o% N5 \) q- c
* x1 b$ B, ]" q, @( R明显差异(P<O。01)。据此，认为目前CPV有三种，即原始株(温度依赖型株)：过渡
8 o. J! y+ j- m# b" Q4 U
型株和变异株(温度不依赖型株)。CPV血凝素结构从与FPLV相关变成差异较大，这种
: J$ i$ P3 u/ W- S. N% I
6 {- r1 m" r/ R转变可以从一个侧面说明CPV的起源；发生机理和发展［7，12］。

Parrish等报道1978年在比利时从自然发病犬的粪中分离得到的CPV，经NLFK细
8 ^$ f; F$ B! ?  b
胞反复传代后，病毒的HA活性很快丧失，HA价在第6代为l：1000，到第24代小于l：
1 @/ @4 h: p7 v5 Q
2，但病毒的增殖并不受影响。用82株CPV单抗所做的竞争性血凝抑制试验(HI)试验

/ M4 ]; S1 z3 o0 V8 |! h! }: @和酶联免疫吸附试验(ELISA)试验证实，cPV无HA突变株和野毒株空原性无明显差异。
6 F9 Q( x% @9 C1 |+ X" W9 c& O
+ X9 Y' [" R% x4 H% c用 M13噬菌体mpl8和mpi9分别克隆野毒株及无HA突变株的VPl和VP2衣壳蛋白基因，
4 ]3 |6 D6 G: `2 W% h
结果发现。两者的VP1和VP2基因的保守区有两个核苷酸序列存在差异，即2243碱基(大

1 c  R  w- f, I! D  z0 ]约77mu)由G突变成A，相应氮基酸由精氨酸突变为赖氨酸；2797碱基(大约88mu)

由G突变成c相应氦基酸由缬氨酸突变成亮氨酸，正是这些变化影响了病毒衣壳蛋白的

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红细胞结合位点，造成HA活性的丧失。
* N- k8 @3 o8 F2 `) D
4 X$ |2 t: D% T$ P* ]  m9 _, {§1．2．3 CPV-2的培养

CPV-2在猫、犬、牛、猴、浣熊和豹等动物细胞培养中均能生长，能在原代、次代

( \  H- |9 y+ }+ c5 T2 {猫胎肾细胞，犬胎的肾、脾、胸腺和肠管细胞，水豹肺细胞系(CCL一64)，浣熊的唾液

5 X, C7 w) C: a3 g. R腺细胞以及牛胎脾细胞内增殖和传代，近年常用MDCK和F81等传代细胞，分离培养病
1 f5 Z3 V( q* @
毒，CPV一2增殖后可引起F81细胞脱落、崩解和破碎等明显细胞病变，病毒虽能在MDCK
2 X5 Y; w. B* S# _! L9 g" `5 d
细胞内良好增殖，但无明显的细胞病变，有时出现细胞圆缩，并常形成核内包涵体。为

查明是否有病毒增殖，最好是取接种后3～5天的细胞单层作免疫荧光抗体染色，当有

8 w% T' q* Z0 B3 J病毒增殖时，细胞核发出明显的荧光；也可取培养液与猪或恒猴红细胞作凝集试验，凝

* s+ d& t) Y/ y  C; Y- F集阳性表面有病毒增殖，但不能肯定是CPV-2，和本属其他病毒对培养细胞的要求相同，

必须在种人细胞不久或同时接种病毒，才能达到增殖的目的，在感染的细胞核内能检出
. u' e; {$ S8 I% C
包涵体。
" P* h1 l8 @1 a% M6 [/ Q& n
§1．2．4致病性

2 {& a: f& R- BCVP一2具有高度的接触传染性，各种年龄的犬都能感染，成年犬一般只出现感染后
# ^# k! D2 g  S7 C8 S
的免疫反应，常无可见临床症状，有时可以出现一过性的白细胞减少，但近年也常发生

成年犬发生严重肠炎并死亡的严重病例。［11］。乳幼犬由于可能从母体获得抗体，所以也较

3 D2 g0 Y* y0 r0 u. E+ ~, @, V少发病，断奶后的幼龄犬最为易感(尤其12周龄以下)，严重流行时，可在幼犬群中迅

速传播。临床表现体温升高，精神沉郁，脱水，呕吐，排出粘液状或带血的稀便(出血
8 v; p) @# A  P( b& a: ^
性肠炎)。l岁以内的犬幼犬，还常发生心肌炎，8周龄以内幼犬的死亡率高达70％，1

岁犬也达30％。犬感染CPV时经常首先看到心肌炎综合症，3～10周龄的幼犬突然死亡，
! L# k& ?) V# ?1 ?
死前常无临床症状，多数病例在应激心奋后死亡。耐过幼犬可能发生心肌损伤和心力衰
0 C, G) a' u3 G& D4 a( N1 j
4 z: A4 C9 H/ E3 M竭，以不耐运动为特征，组织学病变为弥漫性非化脓性心肌炎，病畜白细胞数可减少90％
8 g6 y/ r$ z$ R' a8 c
: k- O. w$ A0 U: `(由于常犬的每mLl．2万个减至每mL余个)，这时可出现很高的死亡率，尤其发生在
0 N! S# o) M  b. P, Y1 w
. u# t9 L4 b* e) O9～12周龄的幼犬，于发病后5天不死亡的病犬，常可逐渐康复。本病发病率和死亡率

9 `$ k, ?: ^% t的变动范围都很大，前者从50％～100％，后者从O％～50％。病理变化以空肠和回肠的肠
* ?6 g# q" n  h( d; ]
炎变化最明显，粘膜发生坏死，肠内空虚或有少量淡黄带血的粘膜，肠系膜淋巴结肿大，
) q8 z, y. B8 V7 E) C" ^0 x- [5 h
切面点状出血。作组织学检验时，可于肠腺上皮细胞内发生核内包涵体。

因在疾病过程中发生病毒血症，CPV一2随粪便、尿、唾液和呕吐物大量排出于外界。
# k/ U& |' s* }# |5 `% ?7 C' {
健康易感犬直接接触病犬、摄入污染的食物和饮水或接触污染的食具、垫草等而遭受感
1 g4 c0 M1 U6 g6 A5 G
染。
4 P- S9 S+ M; c7 d3 K
5 w) m, Q. w1 G! m& M5 W/ b§1．2．5免疫
. _* i  f) T1 f6 s4 g% T( }2 {' A
病犬康复后能获得坚强的免疫力。由母体初乳传给幼犬的被动免疫可持续4～5周，

) D# @+ l: F3 H0 B. m幼犬断奶后即应进行疫苗接种。
+ E7 q  U: ^) i% l
; {. I. X1 Q+ W& H4 m# C1 n5 z- C4 d在预防上最早使用的是福尔马林灭活的猫乏白细胞减少症疫苗，也曾少量试用过猫
: O, j' E( w- B3 R4 i9 r) n
, }! @7 e+ X9 K* W猫乏白细胞减少症弱毒疫苗，随后又相续研究出了CPV一2灭活疫苗和弱毒疫苗。据1980


9 {! c) |* a- H- J% J( I- L

1 {- R, u( R0 @% c% W: o) v5 T
. b" I. i7 k/ Y' y年Lenghaus等的研究资料。［32］虽然CPV-2和FPV之间具有共同抗原组分，能发生交叉
1 z* n7 F! E' |9 m
4 p6 ^$ f( e7 A: c5 T' X血清学反应，但两者又各有其特性。两种病毒抗血清的交叉中和试验结果(血清稀释法)

是：抗CPV-2血清对CPV-2的中和效价为l：4000，而对FPV则为1：1000：抗FPV血
# u9 g& I! z. ^5 q2 Z9 K) s
清对FPV的中和效价为l：32000，而对CPV则为l：2000。另据1979年Appel［17］等的
/ m; J( Z* q2 J9 C( S1 U
2 g( n0 {! S" W2 U/ |; K* }/ E- v动物免疫和攻毒试验结果，也看到了两种病毒抗原间的明显区别差异：CPV-2疫苗免疫

的犬，攻毒前血凝抑制抗体为1：3200～6400，用CPV-2强毒攻后，抗体效价基本未动：
8 [# r7 W  h# _
而用猫泛白细胞减少症疫苗免疫的犬，攻毒前血凝抑制抗体效价为1：160～320，用CPV-2

强毒攻击后，抗体效价激增到l：3200～6400。上述两项试验都表明这两种病毒抗原虽

有共同组分，但又有自己的特异成份，因此无论疫苗制造和特异性诊断方法都以应用
* M7 G: R+ u+ S
3 Y, i- F% L, H8 m# _7 D- o4 O. `CPV一2为宜。
# p7 h- G7 D& Y; x3 g, {
! Z$ u  o8 o# a7 h8 M& b3 \0 P. yLope等［49］(1992)在昆虫杆壮病毒表达系统中表达了CPV-2的VP2蛋白，表达的

VP2蛋白可自我装配成空衣壳。lOug表达蛋白与免疫佐剂一起可使犬产生良好的免疫反

2 C  l4 k) K4 v2 I应。Langeveld E~等(1994)合成的位于VP2氨基端21个氨基酸内有部分重叠的两段多
0 a/ k8 {+ N* F( ~/ Z
肽，分别免疫犬，不但都能产生免疫保护反应，还可用针对第二个多肽3～10个氨基酸
* t& L2 w3 @' k9 D+ D4 e
, ]  s" j: ]$ ?0 Q的单克隆抗体可以区别疫苗接种和自然感染的犬。
0 _. T4 w/ R* j! d
# L6 }+ w3 p* E5 ?4 a§1．3 CPV一2的分子生物学特性

§1．3．1 CPV-2的基因组结构

5 s. K% y" _1 y9 a( wCPV-2的基因组是单链、负义、线形DNA［28］。基因组容量在动物DNA病毒中是最小
  f$ o6 V, D, G+ _- s
的，全长5323个核苷酸。在基因组互补链(c链)上有两个主要的开放阅读框架(Open
1 D6 ^: `$ t2 Y2 v
reading frames，ORFs)，5’端的ORF编码非结构蛋白(668个氨基酸)，即早期转录的

7 J2 P$ O0 ]# a  v# m调节蛋白(NSl和NS2)；3’端的ORF编码结构蛋白(722个氨基酸)，即晚期转录的病

1 h5 [; U* C; J6 R毒衣壳蛋白(VPl和VP2)。两个ORFs分别有各自独立的启动子，但它们的mRNAs终止

于共同的POLY(A)末端(图谱位置在94～96mu)。通过mRNA的可变剪接形成不同的翻译
7 ~1 [2 v- c9 X$ T! V/ [
摸板。基因组的5’末端包含一些可变数目的串联直接重复序列，具体功能尚不清楚。
, |" x$ W* _& {- Y0 @
9 F0 G, p9 y) u( T6 ~' f8 v) ]7 _§1．3．2 CPV-2编码的蛋白及功能
* y+ Z" \# {6 v  ]
CPV一2主要编码四种蛋白，由早期转录物翻译的非结构蛋白NSI和NS2。由晚期转

录物翻译的结构蛋白VPl和VP2。VPl(82KD)蛋白氨基酸序列包括整个VP2(67KD)蛋

$ w9 k2 s" h; _0 h  Z! n6 J6 e白的氨基酸序列，且终止于共同的c端。另外VPl蛋白又比VP2蛋白在其氨基端多出一
5 G2 F$ L4 T9 g9 [# y
/ k  i7 R* k$ N/ ~0 N. Q段序列(143个氮基酸残基)，且富含碱性氨基酸残基。传染性病毒粒子包含60个蛋白亚

) c0 }; l+ g2 n) M9 @, E  N9 d% [基，主要由VP2亚基、少量的VPl和VP3亚基组成。VPI和VP2是经过病毒DNA转录而

) d, r  r" G3 Z/ M/ e" e, b成的mRNA可变剪接形成。VP3仅仅存在于完整的病毒粒子的衣壳蛋白中，是VP2的氨基

$ d2 S1 h+ {7 c% Z5 G, f末端切去15～20个氨基酸形成。病毒在体外和活体中繁殖通常产生大量的空壳粒子，

空壳粒子不包括VP3，大部分是VP2，仅含少量VPl亚基。同时，也有证据显示杆状病
& g' L+ i! e1 Y9 ?6 ~' q- O4 M
- h" _& }0 F7 b9 v+ U* w! v$ i毒或疫苗载体表达的仅仅由VP2组装的CPV一2空衣壳和真正的空衣壳在抗原性上相似，

说明VPl和VP2在功能上可能具有相同的作用。结构蛋白VP2是由8组反平行的β－折

xxjpz

叠链和插入反平行的β－折叠链之间的4个环组成。四个环组成病毒衣壳表面的大部分，
; t. U: K5 t, L( a% ?" R
环3和4构成围绕三倍体对称轴突起的整个结构。

§1．3．3 CPV-2的衣壳结构

# |( y  G, l9 x$ d$ E, z+ J2 fCPV-2的病毒粒子为T：I的二十面体对称结构。病毒无囊膜。在电镜下呈圆形或六
0 f* E, l: Q+ W9 A
% B9 g( d) k% p) ~3 H角型。直径约25nm，衣壳由32个长约3～4nm的壳粒组成。CPV一2和FPV所有生物学上
' V. a6 a2 ^. W. D$ o: D- q- I
- {- e! N, K6 t; B6 {* w& J7 H8 _的不同都是由病毒衣壳蛋白和结构决定的，完整CPV一2的衣壳结构(包含DNA)或空CPV-2

: B2 n8 w/ w' i的衣壳结构通过x一射线结晶学已经被测定。在病毒的衣壳表面有大量的显著特征［31］：①

在每个三倍体对称轴上有一个突起(Spike)长2．2nm，直径7nm。②在每个五倍体对称

8 S. f7 V* A, {# a轴上形成一个圆桶型结构，由五对反平行的B链组成，每个反平行的0链之间由氢键
. g% M( ^$ g& E; J# G- |# m# O
; [4 }  w# y! v/ V9 S& X# _连接。圆桶型结构的内部直径分别为，在病毒半径11．3nm处是1．4nm，在病毒半径12．7nm
2 M6 m2 M' E- Q$ z& P# C: T( f" d7 R
3 ~. L% D# S: V* t% a处是2．2nm。③在两个三倍体突起之间，二倍体对称轴上有一条凹陷(Dimple)，深1．5nm。
6 Z% }7 N( h! `, B2 P! b9 v
6 W- B0 {' y+ P, q4 @7 j2 H4 o④在每个五倍体对称轴上的桶型结构外边环绕着一条峡谷(Canyon)，宽1．1nm，峡谷底

4 j9 y& f/ L( l部距桶型结构的顶点是O．9nm，高1．5nm的嵴从二倍体对称轴处将峡谷分开。病毒的半
1 j7 \' `+ [% {: P0 m+ ~0 v' N+ k0 R7 p
) r7 H, [: B, @: P径在三倍体轴处是14nm，沿着五倍体轴是13．2nm，沿着二倍体轴是11．2nm，在峡谷底
8 x9 [9 K2 e- ]1 Y
部半径是11．7nm。
# V, E) I! r& }( U/ s* x
8 Z9 i1 V: }0 T§1．3．4 CPV～2的衣壳结构功能区
; ]; r5 g6 b9 C; a; B# H& z" p
通过对编码结构蛋白的深入研究，诸如采用基因缺失、重组图谱、编译框移位、确
; A# Y0 m* [. ^9 d# y( e
定的位点诱变、蛋白氨基酸序列的对比分析、并结合免疫化学分析手段，明确了CPV-2

编码蛋白的一些功能。
* `; R7 T. Z: k" H/ i$ h! z  @
0 I# ?; _9 n: |, B; C3 d  ol 3．4．1 CPV 2的抗原决定簇区

- ~$ T2 u( N9 J' ?5 nCPV-2的抗原决定簇区主要分布于比较暴露的蛋白衣壳表面。根据肽图谱定位发现
  z5 {) b6 v4 S: P' H3 A
6 G) u3 U1 h6 `% @. n  p" s+ a［12，14］抗原表位存在于三倍体突起、VP2的氨基端、凹陷内和五倍体对称轴附近，如抗原

- M$ O& l& J" E- B, I表位残基Ala300在病毒的最外边，即形成三倍体轴突起的一个环的顶部。残基Asn93
- B! |0 ?' U* b& o$ [  f1 e4 V
+ o6 L4 K1 X( v  f" \* X( ~也在三倍体轴突起的最外边。利用单克隆抗体显示［55］，两个主要的抗原区在病毒的三倍
4 Z# ]: R4 \4 _, T9 j, I5 L/ |; U
体突起上。一个区域在三倍体突起顶部的附近，第二个区域在残基300附近，即三倍体

突起的肩部，但也有少数单抗和这两个部位无关，指示它们的抗原表位可能在其他部位。
" X( i" r8 E7 L- W+ X, m( k
研究发现，在VP2亚基的N端和c端也有抗原区存在，因为对应VP2残基l一23的肽和
0 L( f/ w; X/ P0 U% J
两个单抗反应。从以上事例可以看出，CPV一2至少有三个抗原表位区，①环l和环3

附近的区域；②二倍体对称轴的下陷和三倍体对称轴突起之间的区域；③临近三倍体对

! z; {% _7 B7 ~) h称轴突起的中心区。

3 z+ a; k6 C/ Z% [§1．3．4．2 CPV一2的受体结合部位

& P/ c  |5 L0 m  n* a& {采用特异性抗体封闭以及结合精细的编码结构蛋白基因的缺失和重组体共转染易
. ~% G. Z7 \' o
感细胞的研究，发现VPl、VP2蛋白在细小病毒感染过程中起着极为重要的作用。缺失

1 ]: o) d1 _, e: ^2 W) ^% JVPl和VP2蛋白的突变体均丧失了对宿主细胞的再感染性。对CPV-2结构蛋白的分析及
+ P0 {& v3 L* M0 Y( @* V* @
编码基因突变的研究，发现CPV 2衣壳蛋白某些区域，甚至几个残基对CPV一2侵染细胞
" U# i( J& t) a& E0 i3 _4 w
- i5 Q0 {& q( W$ E


: d( J$ g8 c) M
第六页缺失

1 S) U2 N3 e+ k) R" W2 |
$ I' I6 F* z  x. r7 t) ?


5 Q4 _" w3 j5 h. v0 z2 H+ R3 f
" ~& S% O  F3 d' _
退。最后因水、电解质平衡失调，并发酸中毒，常在腹泻后1～3天内死亡。体温升高

" S( e  Q" }& j& j( B" Q到40～4l℃，但也有体温始终不高的。有的病犬腹泻可持续1周多。血液检查，白细胞
8 W( D- D# C4 a% N! M
总数明显减少，尤其是在发病的第5～6天最为明显，常在3000／mm3以下，血清总蛋白

3 l" C/ g2 @9 ]. i. b  t量下降至4．2～6．6mg%，红细胞压容为45—7l，平均在50左右，转氨霉指数升高，发

  I# D( ~4 I9 ]0 \8 a, g病率为20％～100％，死亡率为10％～50％。
+ I. d6 w; v: G2 N- \$ J
§2．3．2心肌炎型犬细小病毒病
9 O$ N& A& X, B0 H5 _3 y; n5 D2 b
: `2 H! h( u% V& ?( M: j此型多见于4～6周龄的幼犬。发病的特别是临床症状未出现就突然死亡，或者出

+ u" y( R" M% U7 o- x& Q; d* c现严重的呼吸困难之后死亡。病程稍长的病理，发病初期精神尚好，或仅有轻度腹泻，

1 a% p# _- ?$ D3 U' u常突然病情加重，可视粘膜苍白，病犬迅速衰竭，呼吸极度困难，心区听诊有明显的心

* x6 q; U7 F' L内杂音，常因急性心力衰竭而突然死亡。死亡率为60％～100％。

: M, A- l9 M% Q: J§2．4病理变化
7 q$ x! |" S2 i) E/ m
§2．4．1肠炎型

小肠中段和后段肠腔扩张，浆膜下出血变为暗红色，肠系膜淋巴结肿胀、充血。有
- P/ ^$ }" \& ^! R) m
* C4 |, N$ @2 {) T! K! l, i0 f些病例，整个小肠表现充血和明显出血。组织学变化主要见于空肠、回肠，肠绒毛明显
4 t1 N# R% r3 K! y* g
萎缩，肠腺消失，甚至粘膜严重剥脱，肝细局灶性坏死，少数动物干细胞和胆管上皮细
6 y4 L, V6 N  ]  I0 s$ b/ `1 F
8 M+ I/ a# L: Q9 S& M/ W胞中有嗜酸性核内包涵体。
4 [3 z& t- m6 H3 a; }
§2．4．2心肌炎型
9 Q% K4 N* {0 j; L0 w! |7 Y" _
肺水肿，由于局灶充血和出血，肺表面色彩斑驳。心脏扩张，两侧心房、心室有界
' c3 h& @. a# d- @0 y
限不明显的苍白区，心肌和心内膜有非化脓性坏死早，心肌纤维严重损伤，出现出血性

& Q1 l" b* p8 N4 [: _+ [0 p斑纹［13］。
0 B+ F3 D- T% y8 k8 q
§2．5组织学检查

, y0 T1 D* j( I. V取13例病死犬病料做石蜡切片，苏木素——伊红双色染色法，镜下可见：小肠和
( v2 O5 j, W" Q' U2 g' k( a
大肠粘膜变性、坏死和脱落，毛细血管充血，绒毛萎缩，隐窝萎陷或扩张，肠上皮细胞

1 a* J  h0 A. ~3 {! u! {内有核内包涵体。胃粘膜上皮变性、坏死和脱落，毛细血管充血。脾红，白髓界限不清，
; ~; G$ g! V/ I* @5 ?
皮窦、髓窦充血、出血，生发中心萎缩、消失。肝脂肪变性、颗粒变性，肝细胞核浓缩、
( Z7 z+ F( y9 H6 W4 \/ R
碎裂及崩解。肾毛细血管尤其是髓质毛细血管充血，肾小管上皮细胞颗粒变性，肾小管
1 t3 ~5 [6 Q) ?1 H
腔有管型存在。在13例中，有5例心肌炎型的病犬，心肌肥厚，心包积液，肺叶边缘

有瘀血，肝肿大，其它组织病变不十分明显。做心肌石蜡切片，可见心脏纤维颗粒变性

间质毛细血管偶见充血，有的心肌或心内膜有非化脓性坏死灶，常见出血性斑纹，心
+ p1 q/ s1 v$ \
肌损伤部位的细胞内可见核内包涵体。
- j( @; w, P$ N. g' i9 n6 B
4 L8 K4 i, w3 ]§2．6鉴别诊断
& ?9 w. m$ m- e' v( S7 s; A
: C6 ]5 |) l$ v$ l应注意与犬瘟热，传染性肝炎、冠状病毒病及菌痢相鉴别。鉴别诊断应注意与犬

/ b/ G8 `! x0 C0 |瘟热，传染性肝炎、冠状病毒病及菌痢相鉴别
( {% m: O) W- ^+ z
3 O8 g) d' w" `1 h0 }# z§2．6．1犬瘟热
- i$ k# u3 z: d: k
以双相体温升高，白细胞减少，急性鼻卡他以及随后的支气管炎他肺炎、严重的胃


3 c" s, X/ a9 J' u
( T; U9 A1 x0 j
0 E+ |. }  a5 W1 P0 _, r
肠炎和神经症状为特征。而犬细小病毒病则惧呕吐、腹泻、血便、迅速脱水为主。

; v. {: w0 W2 G/ B  t. J§2．6．2传染性肝炎
. ~2 X  M# g$ B0 N4 A  ^! {
; H! u3 H, r& `! ^  `6 f, g* }“马鞍”型体温曲线，呕吐、腹泻、牙龈出血、剑状软骨部位出现腹痛，出血时间

延长，急性疾状消失后一眼或双眼暂时性角膜混浊，渴欲增高。
+ e( u% _: i% h. Z$ |% H* S" x) M
§2．6．3冠状病毒病

6 M7 R; @( P3 s% M1 w- ?l临床上，主要表现为胃肠为症状，确诊应借助于电镜，鉴别病毒，如CCV、CPV、ISIIV。

§2．6．4菌痢

以沙门氏菌、痢疾杆菌、致死性大肠杆菌、空肠弯曲菌感染为主的肠炎。以脓冻样
" W" U* U+ T" Q! t' \
稀便多见，一般出现血便，抗生素治疗效果明显，而细小病毒引起的犬腹泻，潜血反应

' Y$ u4 V7 K0 t, w. i为阳性，抗生素治疗无效。

7 p' J3 h5 @& H! f§2．7免疫预防

( i1 C) T8 r$ n' T! j自1982年以来，国内一些警犬、军犬部门及科研单位，曾先后从美国、西德引进
: T& F# w, a  `
1 D. t# |# G; N  I2 G9 {: V. }5 JCPV灭活菌、弱毒苗及猫泛白细胞减少症疫苗等用于预防CPV病，但效果均不理想，不

能控制本病德发生和流行。而近年来应用解放军兽医大学军事兽研所研制的CPV弱毒疫

3 p( L6 }6 k2 z7 m7 I) u苗和公安部南京警犬研究所研制的CPV—GNl灭活疫苗以来，能有效地预防本病的发生和

2 H0 _1 c. }% s流行，故在国内广泛应用。

" C2 M7 R% ^1 }0 T§2．7．1免疫程序：

国产CPV弱毒苗和CPV—GNl灭活苗对1．5～3月龄幼犬免疫二次(间隔两周)，每次肌
8 |2 r2 F9 f6 E
肉或皮下注射，免疫期为1年．发生疫情时，可用本疫苗做紧急预防。pollock等研究指

" l1 h/ e3 v7 L* D出，血清H1效价超过1：80的犬即可抵抗CPV感染。在攻毒实验中发现CPV-GNl灭活
  q$ E3 R, c% D4 q2 h, _. B
苗二次免疫后，抗体效价超过1：80，攻毒后全部得到保护。从实验结果看，接种一次

疫苗后，犬血清效价很难都达到l：80以上，而在第二次免疫后，效价均有明显提高。

因此，CPV-GNl灭活苗在临床应用时应间隔两周进行重复注苗。国产CPV弱毒苗也是如

4 m* |6 Y. v& U( x; z此。在免疫过程中，要采用合理的免疫程序，除对幼犬免疫外，还应对怀孕中期的母犬
5 I7 ~/ \" }6 Z6 B
和其它成年犬进行免疫，不但可提高母源抗体水平，同时也可减少临床正常犬的排毒现

. ~0 W( j- A5 o! m* }象。

§2．7．2免疫效果：
& I" b0 e# F  d# |, o. g& e- _- Q
  C: T! q8 p' o  k, i/ Z叶俊华［16］等通过对国产CPV弱毒疫苗和从美国引进的CPV弱毒苗“Parvoid”(系号：
; \/ v8 ]% x5 H" x$ o
25053A)的对比实验(包括疫苗安全性试验，排毒与同居感染试验以及较大范围的田间

临床实际应用观察)，说明国产CPV弱毒苗安全可靠，其效果优于美国引进的CPV弱毒

: Q4 j6 R) a( w苗。在疫苗接种对照试验中，所有试验犬(30条)，注德国产CPV弱毒苗后，其它血凝

抑制抗体滴度均由阴性(1．8以下)上升达1：128以上，试验犬均能抵抗自然强毒感染，

2 }! I9 ^7 ]5 g5 T# X/ t但在犬已潜伏感染CPV强毒时接种本疫苗则无治疗作用。用国产CPV弱毒苗共免疫1076

条犬，结果有效1067条，保护率达99．12(发病9条犬中由6条时注苗前已有CPV感染
$ O& X1 H: l: S' |( M
6 b4 u; i+ z, F3 q1 N, Q; g症二紧急注苗的)。



$ x2 }9 u! A+ Q4 f
; ^8 m3 U; f) N: ~' z' L$ W

6 @- p( i, C3 Y
徐汉坤［12］等以分离南京病犬的犬细小病毒CPV—GNI毒株，研制成细小病毒细胞培养
. J8 F7 k1 H" o5 K6 C) i3 n
灭活疫苗用于免疫试验，发现CPV—GNI灭活苗免疫后无不良反应和排毒现象，安全可靠。
, j2 \' ?4 }, W, J9 q
5 p  @$ x+ O" l  `一次免疫后，HI效价在1：40以上，二次免疫后多在1：80以上，口服攻击强毒后均无
! z0 A% W% E" K3 R: M
# v2 B$ ]. z# Y  g8 a: ]8 n临床症状和排毒现象。20周后，免疫犬抗体水平仍在l：80以上。

洽足七品茶

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# O( S; y4 w) Q9 F; w2 e) w( P松狮犬信息
6 v/ q4 n) N/ d% s. U红松狮狗