程度军区军犬病毒性胃肠炎的病原调查及防止研究

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<table cellspacing="1" cellpadding="4" width="593" border="0"><tbody><tr><td align="center">『 <font size="4">成都军区军犬病毒性胃肠炎的病原调查及防治研究（I） </font>』 </td></tr><tr><td align="center"><table cellspacing="1" cellpadding="4" width="86%" border="0"><tbody><tr><td><br/>成都军区在13、14集团军、西藏、省军区共装备军犬350条，因许多团队、仓库根据自己部队需要，自行饲养了不少工作犬，据96年成都军区兽医卫生员培训班所作统计，在我区内实际拥有军犬1500只（96年5月数字）。军犬是我军战斗力组成不可缺少的一部分。但是由于军犬胃肠炎的流行给我们军区军犬的发展造成了极大的损失。为响应解放军三总部 1995年下发的参务字第50号通知关于《军犬管理工作规范》要求对犬的五种烈性传染病犬细小病毒肠炎（CPE）、犬瘟热（CD）、犬传染性肝炎（ICE）、犬冠状病毒肠炎（CCE）、狂犬病（PV）每年进行普查和上报。我所用本研究组及解放军农牧大学研究所犬病中心已建立的诊断方法对我区在1995—1998年间部队送检的犬粪便以及我们所采的发生腹泻病犬粪便140份样品，进行了CPE、CD、ICH、CCE病原检查，查明了在我区军犬间传播和流行的病原主要以CDV为主，CPE已处于次要位置，ICHV和CCV引起的疾病并不十分严重，很少有大面积流行的情况，并针对成都军区病原流行特点趋势，进行了预防和治疗研究。 <br/><br/><br/>一、腹泻犬粪便病原检查及结果 <br/><br/><br/>（一）犬细小病毒的检查及结果分析 <br/><br/><br/>1.粪便样品的处理 <br/><br/><br/>对从1995年—1997年3月份期间部队送检的及我们采集的140份犬粪便，取少许加入 Appdof离心管中，用生理盐水作10倍稀释，5000rpm乘以10离心取上清放零下20摄氏度冰箱待检。 <br/><br/><br/>2.犬细小病毒的诊断及判断标准 <br/><br/><br/>对犬细小病毒的诊断，采用改良的血凝（HA）和血凝抑制试验，在96孔微量血凝板上进行，详见后附文章。以测定列凝集终点比抑制列高2孔以上者，判为细小病毒阳性。 <br/><br/><br/>3.检查结果及分析 <br/><br/><br/>从140份粪便中，细小病毒阳性27份，占19.20%，其中1995年占18份，1996年7 份，1997年2份，1998年1—3月未检出，从发病的年份来看，1995年占的比例较大，94 后年曾是成都军区军犬危害最大的传染病，而97年后发病就很少了，这可能与主动免疫的疫苗效果有关。自1996年后许多单位使用农牧大学军事兽医研究所的百司特疫苗，此疫苗对犬细小病毒免疫效果是国内最好的，经我们抽样所做的初步免疫试验也证明了这一点。 <br/><br/><br/>（二）犬腺病毒的PCR检查及结果分析 <br/><br/><br/>1.犬粪便样品的处理及模板的制备 <br/><br/><br/>取冻存粪便离心上清液，参照萨姆布鲁克莱的方法提取腺病毒的核酸，将上清液中加入抽提液（10mmol/L Tris—HCI ,Ph8.0；0.1mol/L EDTA,ph8.0；20ag/ml胰RNA酶；0.5%SDS） 37摄氏度1小时；加入蛋白酶K100ag/ml,室温作用1小时，加入等体积的TB饱和酚：仿：醇（25：24：1）抽提一次，4摄氏度8000g离心20min，取上清加入0.2倍体积100mol/L 乙酸铵和2倍体积的无水乙醇，室温作用30min，12000g离心20 min，沉淀用70%乙醇洗 2次，干燥，用100al 水溶液DNA备用。 <br/><br/><br/>2. PCR反应引物的选择 <br/><br/><br/>上游引物 P11 5’ GCATGCTCCAACCGTACGTTCATT 3’ <br/><br/><br/>下游引物 P12 5’ CGCTTCTGTGCTCTAAGCTAGCC 3’ <br/><br/><br/>扩增CAV1和CAV2片段的理论长度分别为520bp和103 bp <br/><br/><br/>3. PCR反应体系和循环条件 <br/><br/><br/>PCR反应条件10乘以PCR缓冲缓5al、250mmol/L MgC12 5al、2.5mmol/L 4Dntp 4al、 上下游引物（2.5pmol/1）各1al，模板1al，Tap DNA聚合酶1a，用水补足50al，同时设立该病毒的阳性对照、阴性对照、无模板的空白对照。 <br/><br/><br/>PCR扩增的循环条件 98摄氏度min，96摄氏度40s,50摄氏度min，72摄氏度min循环35次，72摄氏度5min。 <br/><br/><br/>4结果判断标准及检查结果 <br/><br/><br/>电泳完毕合时行琼脂糖电泳，以出现理论长度电泳带Ad—I为520bp、Ad—II为1030bp。在阴阳性及空白对照成立的条件下,即可作出阳性判定,从140份粪便样品中,共检出Ad阳性16份,其中Ad—I型（引起犬传染性肝炎）5份，Ad—II（引起犬群咳嗽及腹泻）11份。Ad—I Ad—I型各年份发病例数无明显差异，Ad--II在1995年仅2份，1996年4份；1997年5份，结果表明，犬腺病毒Ad—I在成都军区流行并不十分严重，而Ad—II国外一直认为仅引起幼犬咳嗽，但从我们调查的结果看，却引起几起传染性腹泻，可能是Ad变异后引起病毒亲嗜的部位改变而造成的。正在作进一步分子流行病学调查。 <br/><br/><br/>（三）犬瘟热病毒的RT—PCR检查及结果分析 1．粪便样品的处理及病毒cDNA模板的制备同细小病毒检查一样，粪便离心取上清，取100al参照Hertig等的方法；加入100al 2倍裂解液（20mmol/L Tria HCL ,PH7.0，20mmol/ L EDTA,8mol/L DTT,4%SDS,4mg/ml蛋白酶K）；室温作用加15min, / L NaCI至电终浓度为0.5mol/L；用3倍体积的水饱和酚：氯仿：异醇（25：24：1）抽提一次；加入0.1倍体积的4mol/L NaAc(Ph5.2),2.5倍体积的无水乙醇20摄氏度2小时。4摄氏度12000g离心15min，弃上清，沉淀用70%乙醇洗一次，溶于适量水中。加入反转录反应体系取5反转录缓冲液4al,2.5mmol/L4DNTP3al,Pnasin40a,Oligo(dT)2al和引物1和21al,AM反转录酶5a，用水补至20al，42摄氏度1小时，取出备用。 <br/><br/><br/>2．PCR反应引物的选择 <br/><br/><br/>犬瘟热病毒： <br/><br/><br/>上游引物 P1 5’ ACTTGCAGGTGTAGCTTTAGG3’ <br/><br/><br/>下游引物 P2 5’ AATAGGATCACGTAAACTCGG 3’ <br/><br/><br/>扩增片段的理论长度为325bp. <br/><br/><br/>3.PCR反应体系及循环条件 <br/><br/><br/>反应体系同犬腺病毒体系、循环条件先进行以下10个循环，98摄氏度变性30’’；46摄氏度退火90摄氏度，72摄氏度延促180’’,再进行以下25个循环,96摄氏度变性60’’,48摄氏度退火60’’,72摄氏度延伸150’’。 <br/><br/><br/>4.结果判断标准及检查结果分析 <br/><br/><br/>将PCR反应结果进行琼脂糖凝胶电池，在阴、阳、空白对照成立的条件下，以出现理论值325bp的电泳带，判为阳性。从140份粪例中，共检出47份阳性，其中1995年13份，1996年19份，1997年15份，从检查结果看，犬瘟热目前是威胁成都军区军犬最大的传染病。从免疫效果看，1997年后发病率虽有所下降，但仍不能完全控制。所以今后成都军区军犬防疫的重点应放在犬瘟热上。从犬瘟热全国流行情况看，成都军区军犬的发病率不高，这可能与我们提出的合理免疫程序以及用犬瘟热单苗加强免疫犬有关，从发病率来看，主动免疫还是取得一定效果的。 <br/><br/><br/>（四）犬冠状病毒的RT—PCR检查及结果分析 <br/><br/><br/>1.引物的设计 <br/><br/><br/>犬冠状病毒： <br/><br/><br/>上游引物 P3 5’ TTGTTCAACCAATTAGCACCGG 3’ <br/><br/><br/>下游引物 P4 5’ CAAGAACCACCAATGTTAGGCC 3’ <br/><br/><br/>扩增片段的理论长度为343bp. <br/><br/><br/>2.粪便样品的处理及病毒cDNA模权的制备同犬瘟热病毒。 <br/><br/><br/>3.PCR反应体系及循环条件 <br/><br/><br/>PCR反应体系也同CD、循环参数为；96摄氏度变性60’’,50摄氏度退炎60’’,72摄氏度延伸40’’,35’’个循环。 <br/><br/><br/>4. PCR结果判定及循环条件 <br/><br/><br/>在对照成立的情况下，以出现343bp理论值大小的片断，定为犬冠状病毒阳性。在140份样品中，共检出45份犬冠状病毒阳性粪便，犬冠状病毒发病率虽然高，但引起的临床症状却不严重。 <br/><br/><br/>从我们调查阳性粪便同犬队有记录的档案对照来看，犬冠状病毒在我区军犬中，仅引起一过性（3—9天）轻度腹泻，体温、饮食正常，不引起严重的腹泻及死亡。在这45份阳性粪便中，也有29份检出犬瘟热，6月份检出犬细小病毒，3份检出犬腺病毒。这表明 CCV常与其它病原混合感染，因CCV仅在犬肠道增殖，只有口服免疫，肠道局部IgA抗体才能起主要保护作用。所以CCE主动免疫不能起多大作用，还会增加免疫成本，我们认为对成都军区军犬CCV免疫不作重点，如果把CD、CPV、Ad免疫工作做好，CCV单独发病就很少了、即使发病也来严重，用犬痢停等一些中药很快就可心加以控制和治愈。 <br/></td></tr></tbody></table></td></tr></tbody></table>

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<table cellspacing="1" cellpadding="4" width="593" border="0"><tbody><tr><td align="center">『 <font size="4">成都军区军犬病毒性胃肠炎的病原调查及防治研究（Ⅱ） </font>』 </td></tr><tr><td align="center"><table cellspacing="1" cellpadding="4" width="86%" border="0"><tbody><tr><td><br/>二、对市场上几种犬多联疫苗评价及适合我区军犬免疫程序研究 <br/><br/><br/>因我国养犬业起步较晚，国家对犬病重视程度还不够，也没有指定哪家生物制品厂有批号正式生产，也没有用细胞系生产动物疫苗的标准，所以国内犬用疫苗均由几家研究机构生产的中试产品；在国内市场上销售量较大的有以下几家：（1）解放军农牧大学军事兽医研究所生产的百司特牌犬五联苗系列；（2）长春某大学生产的犬五联苗；（3）沈阳军区某单位；（4）江苏某单位；（5）陕西某单位等几个部门，因缺少有效的监督机构，国家也无疫苗质量标准，所以生产的疫苗不规范，并且许多假冒伪劣产品也相继出现，我们军区对军犬的防疫也没有统一管理，均由养犬单位自行解决，通常只能买到部队所驻地地方兽医部门经销的产品，而后者是经济利益出发，什么疫苗进货价格低，购进什么，许多单位经我们调查，犬也是作了多次预防注射但仍然什么病也控制不了。我们对以上几种疫苗地云南省昆明市民政局大型肉犬养殖场进行了初步免疫试验，报告如下： <br/><br/><br/>（一）不同疫苗免疫试验结果 <br/><br/><br/>为民政局肉用种犬养殖场饲养的幼犬，选4窝，每窝在5只以上的2月龄以上，无母源抗体的幼犬，每窝选1只组成5组，进行隔离饲养进行免疫试验。 <br/><br/><br/>2试验方法 <br/><br/><br/>选在有效期内的疫苗，按说明书上的免疫剂量，经皮下注射途径，以15天的间隔对犬进行2次免疫接种，第二天免疫后15天采血离心，取血清作抗体效价测定。 <br/><br/><br/>3抗体测定方法 <br/><br/><br/>（1）CPV抗体测定 <br/><br/><br/>因CPV的血凝抑制抗体是与中和抗体相平行的，HI抗体也较易测定，用我们已建立的微量血凝抑制试验进行，详见后附文章。 <br/><br/><br/>（2）CD抗体测定 <br/><br/><br/>采用微量中和试验进行，选解放军犬病中心从小熊猫里分离出的经系统鉴定的犬瘟热病毒，该毒对MDCK细胞的毒力为10TCID50，在24孔板上进行微量中和试验。以100个TCID50的病毒和经5*、10*~1000*系统稀释的血清在37摄氏度感作2小时后，同步接种MDCK细胞，以第5天出现拉网样细胞病变的CD感染指标。按Reedmunench法统计计算血清滴度。 <br/><br/><br/>（3）犬腺病毒抗体测定 <br/><br/><br/>同CPV一样，采用微量血凝抑制试验进行，8*抗原为Ad--Ⅰ细胞培养毒，血球为1%新鲜人“O”型红血球。抗体经倍比稀释，加8单位抗原，加1%红血球，在37摄氏度作用1h后判定结果。 <br/><br/><br/>4抗体测定结果 <br/><br/><br/>5结果分析与讨论 <br/><br/><br/>从不同厂家甚至同一单位不同生产部门生产的疫苗，免疫效果也不同，从所测得抗体效价来看，仅有军事兽医研究所生产的疫苗二次免疫后CPV、CD、Ad均能达到保护性抗体效价（犬瘟热中和抗体效价1：100；犬细小病毒HI抗体1：32；犬腺病毒1：16）。 <br/><br/><br/>（二）成都军区军犬免疫失败原因分析 <br/><br/><br/>1从我们初步免疫试验的结果看，不同厂家生产的疫苗差异很大，选择疫苗很重要，如果选择质量不可靠的疫苗，怎么免疫效价也不会达到保护性抗体滴度。但这一点很难做到，因为成都军区军犬管理工作很不正规，对军犬卫生工作没有专业部门加以管理，而是由战士卫生员就地购买，缺乏有效检测机构，所以质量就不能保障。从成都军区不同单位使用情况看，地处大城市如昆明等有犬部门能够使用到正规厂家的疫苗，发病率就低一些，而处在蒙自、开远等僻远地区，从当地兽医部门购进一些质量不好的疫苗，发病率就高一些，今后军区是否应对军犬防疫工作加以管理，由军区兽医部门统一购买并作检测，下发到部队使用，以保障军犬健康。 <br/><br/><br/>2从目前认为效果最好的疫苗免疫情况来看，也有发生犬瘟热的，这可能与犬的日龄与免疫次数有关，犬的免疫失败原因很多，但其中很重要的一条就是受幼犬体内母源抗体的干扰，幼犬如果免疫日龄过早则不起作用；过晚则在免疫失败未开始或追加免疫未完就发病了。犬免疫失败的另一个原因是疫苗保存不当造成失效引起。据我们调查，许多部门因购买疫苗不方便，一次购买许多，即使是好的疫苗，在室温或经常停电的冰箱也会在疫苗标准的有效期提前失败。对犬瘟热来说更易失效，资料表明，在无保护剂情况下，犬瘟热病毒在37摄氏度下的半衰期为2小时。成都军区交通除了几个大城市有飞机直达外，许多部门均需很长时间火车、汽车运输，有的甚至需几天汽车才能到达，这可能也影响了弱毒疫苗中活病毒的数量，造成免疫失败。 <br/><br/><br/>（三）适合我们军区目前疾病流行情况的主动免疫程序探索 <br/><br/><br/>选择目前市场上免疫效果比较好的百司特系列疫苗，经我们在云南省军区军犬队、云南省军区军犬队、云南省畜产公司犬饲养中心等几个部门免疫试验得出以下结论： <br/><br/><br/>（1）对幼犬在20日龄后注射10ml免疫血清，30日龄时再注一次，在40日龄时进行犬瘟热、犬细小病毒肠炎、犬传染性肝炎三联苗第一次免疫，用此苗以1周的间隔连续进行二次免疫后，再用单苗CD作一次免疫。 <br/><br/><br/>（2）再以10天的间隔用CD、CPV、Ad、狂犬病、副流感、犬冠状病毒六联苗进行第4次、第5次免疫注射。 <br/><br/><br/>（3）5月龄~6月龄间再注射一次犬瘟热单苗或犬三联苗。 <br/><br/><br/>（4）成年后犬以15天间隔每年注射2次六联苗，直到退役。 <br/><br/><br/>（5）对从外地购进或地方应征入伍的成年犬，应以10天间隔快速注射三联苗2次，犬瘟热单苗2次，再以15天间隔注射六射苗2次。 </td></tr></tbody></table></td></tr></tbody></table>

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<table cellspacing="1" cellpadding="4" width="593" border="0"><tbody><tr><td align="center">『 <font size="4">成都军区军犬病毒性胃肠炎的病原调查及防治研究（Ⅲ） </font>』 </td></tr><tr><td align="center"><table cellspacing="1" cellpadding="4" width="86%" border="0"><tbody><tr><td><br/>三、犬病毒性胃肠炎的综合治疗研究 <br/><br/><br/>（一）特异性抗犬瘟热、犬细小病毒肠炎、犬传染性肝炎、犬冠状病毒肠炎四联免疫血清及免疫球蛋白。 <br/><br/><br/>用以上四种病毒对试验犬多次主动免疫，无菌分离血清，即是免疫血清，经提纯冻干为免疫球蛋白，用于幼犬主动免疫前的被动免疫，以及发生疫情时紧急预防注射和治疗。经4年临床应用表明，使用血清配合治疗能减轻疫情，缩短病程，提高治愈率。 <br/><br/><br/>（二）“犬痢停”研制 <br/><br/><br/>利用云南特异中草药结合部分西药及用口服补液盐研制成一种用于治疗犬腹泻的特效药“犬痢停”，经三年的临床应用，反应良好，因其保存、使用方便，现已作为我区军犬部门使用的常备药品。该产品具有抗菌素病毒、止泻、补充电介质的功能。 <br/><br/><br/>（三）犬病毒性胃肠炎的综合治疗措施研究 <br/><br/><br/>经和云南省军区军犬队、云南省几家兽医院合作治疗研究，取得以下研究结果。 <br/><br/><br/>1.对发病犬首先早期尽快使用免疫血清，对发病的犬及同群其它犬应尽虫使用免疫血清作为紧急预防。 <br/><br/><br/>2.根据临床症状：采用“先水后盐，先钾后平衡液”的办法。 <br/><br/><br/>（1）补水方法 <br/><br/><br/>①病初消化道功能正常者：自饮盐水即可。 <br/><br/><br/>②后期不能自饮者：静脉人工补液，用我们生产的犬痢停口服补液制剂。补液量按50ml/kg体重计算。每天1～２次。 <br/><br/><br/>③不能静脉注射者：补液量70ml/kg体重，腹腔注射。 <br/><br/><br/>④控制脱水性休克：补胶体液，10%右旋糖酐，剂量每只犬静脉注射250ml。 <br/><br/><br/>⑤控制肠道出血和感染：用氯霉素3g、鞣酸蛋白3g、维生素K30mg，一次内服，以及用犬痢停一口服补液盐适量灌肠。 <br/><br/><br/>（2）补钾方法 <br/><br/><br/>腹泻病要超过3天需要补钾，补钾的方法要遵循“四不宜”的原则： <br/><br/><br/>①浓度不宜过高：钾不能直接静脉注射，易导致心跳停止。为此将10%氯化钾用5%葡萄糖稀释为0.3%深度静度滴入。 <br/><br/><br/>②量不宜过多：病犬日剂量10%氯化钾10ml。 <br/><br/><br/>③速度不宜过快：每分钟滴入20ml 或者每小时滴入400ml（成犬）。 <br/><br/><br/>④补钾不宜过早：少尿时，不宜过早补钾，即输液后见尿补钾。 <br/><br/><br/>（3）补“平衡液”代替“等渗液”纠正酸中毒： <br/><br/><br/>病犬长期未进食，加之消化液和体液大量丧失，使非挥发性酸排出减少，造成酸中毒。治疗酸中毒，除补水补液外，应大量补“平衡液”纠正酸中毒。因治疗时，输入大量等渗盐水补水和钠，但没有考虑氯，导致血氯过高，易造面高氯性酸中毒死亡。 <br/><br/><br/>常采用的“平衡液”有两种： <br/><br/><br/>①乳酸钠和林格尔液：其成分为1.87%乳酸钠溶液1份加林格尔液2份（纠正酸中毒），剂量20ml/kg体重，静脉注入。 <br/><br/><br/>②碳酸氢钠和等渗盐水溶液：其为1.5%碳酸氢钠1份加等渗盐水2份（纠正酸中毒）。剂量20ml/kg体重，静脉注入。 <br/><br/><br/>结论 <br/><br/><br/>1.本课题利用建立的先进诊断技术，查明了成都军区军犬病毒性传染性胃肠炎的病原及流行情况及今后流行趋势。 <br/><br/><br/>2.比较了我国目前生产的用于犬常发几种病毒性胃肠炎疫苗的优劣，为我们军区各部门选购疫苗作了科学性建议。 <br/><br/><br/>3.在分析了我们军区犬免疫失败的基础上，提出了军犬预防的主动免疫及被动免疫程序。 <br/><br/><br/>4.研制了用于病毒性胃肠炎特异性治疗和紧急预防的犬四联高免血清及提纯IgG. <br/><br/><br/>5.研制了用于治疗胃肠炎和快速补充体液电介质的“犬痢停口服补液盐”制剂，该制剂具的抗病毒、迅速止泻、补充电介质等作用。 <br/><br/><br/>6.研究了用于军犬胃肠炎的综合治疗方法。 </td></tr></tbody></table></td></tr></tbody></table>

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